DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

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BIOLOGÍA MOLECULAR

Licenciatura en Quimica

Especialidad: Química Médica

 

Tema 10. La RNA Polimerasa en Procariotas

 

1. Introducción

• La transcripción empieza en una posición precisa

• Nomenclatura:
  

  • Nucleótido de inicio: nucleótido +1

  • Nucleótidos curso abajo: +

  • Nucleótidos curso arriba: -

   

• El inicio de la transcripción implica la interacción entre proteínas y DNA

  • Sitio de interacción: Promotor

    
    
    

• Las bacterias tienen una única RNA polimerasa

• 5 Subunidades

  • b (156 kDa)

  • b’ (151 kDa)

  • a (dos subunidades idénticas) (37 kDa)

  • s 70 (70 kDa)

• Funciones

  • s: Interacciona con secuencias del promotor para determinar el sitio de inicio de la transcripción

  • b y b’ : Subunidades catalíticas

  • a: Regula la frecuencia de iniciación

• Cantidad y actividad celular:

  • Aproximadamente 3.000 moléculas por célula:

    • 1.500 transcribiendo

    • la mayoría de las otras 1.500 asociadas débilmente al DNA, moviendose al azar hasta encontrar una secuencia promotora

• Inicio de la transcripción

  • s70 (factor de iniciación) reconoce las secuencias características del promotor y se une a ellas

  • Induce la unión del resto de las subunidades de la RNA polimerasa: Formación del complejo cerrado

  • Desapareamiento parcial de la doble hélice (aprox 12 bases): Complejo abierto

  • Inicio de la síntesis de RNA

  • Tras la transcripción de las 10 primeras bases ????se suelta

  • Nomenclatura:

    • (b ,b’y 2a): Core enzima

    • (s, b ,b’y 2a): Holoenzima
      
      
      

3. La tasa de inicio de la transcripción depende de las secuencias de los promotores

• La frecuencia de inicio depende de la afinidad del enzima por el promotor

  • Promotores fuertes: alta frecuencia de inicio

  • Promotores débiles: baja frecuencia de inicio

   

• Grado de fortaleza de los promotores

  • Comparación de varios promotores fuertes

  • Regiones consenso:

    • region -10 ( caja TATA o caja Probnow)

    • región -35

    • Importancia de la separación entre ambas cajas

    • Efecto de mutaciones en estas regiones

     

• ¿Todos los promotores tienen las secuencias consenso?

  • Ejemplo: promotor Lac (débil)
    
    
    

• La mayoría de los promotores interaccionan con s 70

• Algunos promotores requieren de factores s alternativos:

  • s 28, s 32, s 38 y s 54

  • Cada uno de ellos reconoce diferentes secuencias consenso
    
    
    
    

• Represores: Su unión en el promotor o en sus cercanías dificulta el inicio de la transcripción

  • Ejemplo: represor lac

• Activadores: Su unión en el promotor o en sus cercanías facilita el inicio de la transcripción

  • Ejemplo: proteína CRP

  
  
  
  

• En bacterias existen sitios específicos de terminación de la transcripción: Terminadores:

  • La RNA polimerasa deja de añadir nucleótidos a la cadena de RNA

  • La RNA polimerasa abandona el DNA
    
    
    

• Secuencias terminadoras

  • Son variables

  • Se sitúan en posición 5’ respecto del sitio de terminación

  • Dos tipos de terminadores en función de que requieran de proteínas accesorias o no.
    
    
    

• Terminadores intrínsecos

  • Estructura secundaria en forma de horquilla

  • Sucesión de 6 U al final de la horquilla

  • Generalmente región rica en G+C en la base del tallo

   

• Terminadores dependientes de Rho

  • Además de una secuencia terminadora similar a la habitual, requieren del factor proteico Rho.

  • Rho: proteína de aprox. 46 kDa que actúa como hexámero

  • Actividad helicasa dependiente de ATP

  • Se une al RNA en secuencias específicas

    • Longitud= 50-90 bases

    • posición 5’ al sitio de terminador

    • Ricas en C y pobres en G

  • Mecanismo de terminación

    • Se une al RNA y avanza en dirección 3’

    • Desestabiliza la unión de la RNA polimerasa una vez que esta alcanza la región terminadora

    • La desestabilización es debida a la disociación del híbrido DNA:RNA

    • El avance de Rho puede verse inhibido por la presencia de ribosomas
      
      
      
      

7. Antiterminación

• Concepto

• Mecanismo:

  • Proteína antiterminadora reconoce secuencia antiterminadora en DNA

  • Proteína antiterminadora interacciona con RNA Polimerasa a través de proteínas intermediarias

  • El complejo estabiliza a la RNA Polimerasa y evita la terminación de la transcripción

  • Ejemplo: Bacteriófago l
    
    
    

• Footprinting

  • La unión de proteínas al DNA protege a éste de la degradación por diversos agentes

  • Footprinting con DNAsa I

    • Las proteínas unidas al DNA le protegen de la degradación por tratamiento con DNAsa I

    • Marcaje de un extremo del DNA

    • Digestión in vitro con DNAsa I

    • Desnaturalización

    • Electroforesis de los fragmentos obtenidos

    • Secuenciación en paralelo

    • Revelado
      
      
      

• Bandshift (EMSA: Electroforetic mobility shift assay)

• La unión de proteínas al DNA supone una disminución de su mobilidad electroforética.

• Metodología:

• Marcaje del DNA

• Incubación con proteínas

• Electroforesis

• Revelado

9. Esquema final