DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

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BIOLOGÍA MOLECULAR

 

Las RNA polimerasas en Eucariotas

 

1. Introducción

• Los eucariotas unicelulares deben adaptarse, al igual que las bacterias, al entorno nutricional

• Las células de metazoos están mas protegidas de los cambios ambientales

• El desarrollo de distintos tipos celulares en metazoos supone la expresión de distintos genes según un patrón determinado. (Animación: desarrollo embrionario de un renacuajo)

• Una gran parte del control sobre la expresión de los genes en eucariotas recae sobre el proceso de iniciación de la transcripción. (Animación: Actividad de la RNA polimerasa)

  
  

• En los núcleos de células eucarióticas se detectan 3 actividades RNA polimerasa diferentes: I, II y III

• Movilidad en cromatografías de intercambio iónico de las distintas RNA polimerasas

• Sensibilidad a a- amanitina de las distintas RNA polimerasas:

  • I.- Muy insensible

  • II.- Muy sensible

  • III.- Sensibilidad intermedia
    
    

• Las distintas RNA polimerasas de eucariotas expresan distintos genes:

  • I.- RNA precursor de los rRNAs (28s, 5,8s y 18s)

  • II.- Genes que codifican para proteínas y 4 RNAs pequeños (snRNAs) implicados en “splicing”

  • III.- tRNA, rRNA5s y otros RNAs pequeños (snRNAs)
    

• Las RNA polimerasas de eucariotas presentan numerosas subunidades:

  • Comparación RNA polimerasas eucariotas con la de E. coli.

  • Subunidades de las RNA polimerasas eucariotas:

    • dos subunidades grandes similares a b y b’ de E. coli

    • Dos subunidades similares a a de E. coli

    • 5 subunidades comunes entre I, II y III pero sin homólogas en E. coli

    • Subunidades adicionales distintas entre I, II y III

• Experimentos de “Knock out” de las distintas subunidades: efectos sobre la viabilidad celular

• La subunidad grande de la RNA polimerasa II presenta numerosas repeticiones en su extremo carboxilo-terminal:

  • Secuencia CTD (Carboxi Terminal Domain): Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser

  • 26 Repeticiones en levaduras

  • 52 Repeticiones en mamíferos

  • Las Ser y Tyr son susceptibles de ser fosforiladas

  • Experimentos de deleción del CTD: Son necesarias al menos 10 copias para que la levadura pueda sobrevivir.
    
    
    
    

3. Secuencias que determinan los sitios de inicio de la transcripción.

• Búsqueda de secuencias consenso:

  • Caja TATA.

    • Localizada entre -25 y -35

    • Mutaciones de una única base disminuyen drásticamente la velocidad de transcripción

    • Cambios de secuencia entre la caja TATA y la posición +1 no afectan a la expresión

    • Conclusión: la caja TATA funciona como el promotor de E. coli colocando a la RNA polimerasa en su sitio correcto para iniciar la transcripción.
      
      

• Iniciador

  • Secuencia poco conservada

  • Puede sustituir a la caja TATA

  • Puede acompañar a la caja TATA
    

• Secuencias ricas en GC

  • Puede acompañar a la caja TATA

  • Aparecen en promotores sin caja TATA, pero son promotores débiles en los que el sitio de inicio no está bien definido
    

• Concepto de promotor en eucariotas

  • Concepto estricto: Secuencias que determinan el sitio de inicio de la transcripción (Regiones que contienen la caja TATA y/o el iniciador)

  • Concepto amplio: Conjunto de secuencias cercanas al sitio de inicio de la transcripción que activan el proceso de expresión génica
    
    

  
  

• Recordatorio del proceso de localización del sitio de inicio de la transcripción en E. coli: papel del factor s

• Localización del sitio de inicio de la transcripción en eucariotas

  • Factores generales de la transcripción: Concepto

    • Se requieren para la transcripción de la mayoría de los genes transcritos por la RNA polimerasa II
      

  • Complejo de iniciación: Factores generales + RNA polimerasa

• Iniciación de la transcripción in vitro: Factores implicados (generales):

  • Unión de TBP a la TATA box

    • TBP interacciona con el surco menor del DNA y curva la doble hélice

    • La superficie de contacto de TBP con el DNA está muy conservada en todos los eucariotas.

    • La superficie de contacto con el DNA está formada por 180 aminoácidos del extremo C-terminal

    • Los 180 aminoácidos del C-terminal son suficientes para activar la transcirpción de los promotores con caja TATA.
      

• Unión de TFIIB:

  • Extremo C-terminal interacciona con TBP y DNA

  • Extremo N-terminal se extiende hacia el sitio de inicio de la transcripción
    

• Unión del complejo formado por un tetrámero de TFIIF y la RNA polimerasa II:

  • la RNA polimerasa queda colocada sobre el sitio de inicio de la transcripción

• Unión de TFIIE: Sirve para unir posteriormente TFIIH (Docking)

• Unión de TFIIH:

  • Factor multimérico formado por 9 subunidades

  • Actividad helicasa: Apertura de la doble hélice con consumo de ATP
    
    

• La hebra molde desnaturalizada entra en el sitio activo de la RNA polimerasa

• Comienza la síntesis de RNA

• El extremo CTD de la RNA polimerasa es fosforilado en varias posiciones

• La RNA polimerasa se suelta de todos los factores de transcripción

• TBP queda unido a la caja TATA
  

• Iniciación in vivo:

  • Además de los anteriores factores, es necesario TFIIA que se une a la caja TATA y a TBP

• Los TAFs (TBP Associated Factors) junto con TBP forman el factor TFIID. En conjunto, pueden iniciar la transcripción en promotores que carecen de caja TATA:

  • Los TAFs pueden unirse al elemento iniciador para iniciar la formación del complejo
    

• Elementos próximos al promotor

  • Localizados en los 200 nucleótidos anteriores al sitio de inicio de la transcripción

  • Activadores: ejemplo GAL4:

    • Promueve la expresión de genes necesarios para metabolizar la galactosa

    • Sitio de unión al DNA: UASGAL (Upstream Activating Sequence)

    • Proteína: Dos dominios funcionales distintos; Dominio de unión al DNA (visualización tridimensional. necesario Cn3d 4.1)y Dominio de activación.

    • Los dominios funcionan por separado.

    • La región que los separa no desempeña ninguna función.

    • Los dominios siguen funcionando al fusionarse a otros factores distintos
      
      

  • Represores: Ejemplo WT1

    • También son proteínas modulares con un dominio de unión al DNA y un dominio de represión

    • Los dominios funcionan por separado

    • Los dominios siguen funcionando al fusionarse a otros factores distintos

    • WT1 bloquea la expresión del factor EGR-1, que a su vez es otro factor de transcripción

    • Individuos homocigotos para una mutación en WT1 no pueden reprimir la expresión de EGR-1, lo que conduce a la formación de tumores en el riñón en los primeros años de vida.
      

• Regiones amplificadoras (Fig 1; Fig 2)

  • Regiones que activan la transcripción de los genes

  • Se sitúan a gran distancia del sitio de inicio de la transcripción

  • Pueden estar curso arriba o curso abajo del sitio de inicio de la transcripción

  • Funcionan orientadas en ambos sentidos

  • Compuestas por numerosos sitios de unión para factores activadores de la transcripción
    

6. Inicio de la transcripción por la RNA polimerasa I

• Expresa los genes que darán lugar a los RNAs ribosomales (rRNAs)

• Utiliza factores generales distintos a los de la RNA polimerasa II

• Se reconocen otros elementos de control en los promotores

• El inicio de la transcripción no requiere hidrólisis de ATP

• Estructura del promotor:

  • Dos regiones de control de la transcripción:

    • Core element: -40 a +5

    • Upstream Control Element (UCE): -155 a -60

• Factores de transcripción (generales):

  • UAF (Upstream Activating Factor) se une al UCE

    • 2 de sus 6 subunidades son histonas

  • Core Factor

    • Trímero

    • Se una al Core Element junto con TBP
      
      
      

7. Inicio de la transcripción por la RNA polimerasa III

• Expresa los genes que darán lugar a los tRNAs y al rRNA 5s

• Utiliza factores generales distintos a los de la RNA polimerasa II

• Se reconocen otros elementos de control en los promotores

• El inicio de la transcripción no requiere hidrólisis de ATP

• Estructura del promotor de tRNAs:
  

  • Localizado dentro de la secuencia transcrita

• Dos elementos de control: Caja A y Caja B
  

• Estructura del promotor de 5s-rRNAs:

  • Localizado dentro de la secuencia transcrita

  • Un elemento de control denominado Caja C

• Factores de transcripción (generales):

  • Promotor de tRNAs:

    • Factores TFIIIB y TFIIIC

    • TFIIIC reconoce los elementos de control

    • TIIIB se une al TFIIIC unido al promotor

    • TFIIIB dirige a la polimerasa al sitio correcto

    • Formando parte de TFIIIB está TBP, que se une al DNA a pesar de que estos promotores no tienen caja TATA .

  • Promotor de 5s-rRNA

    • Factores TFIIIA, TFIIIB y TFIIIC

    • TFIIIA se une a la caja C

    • TFIIIC se une al TFIIIA unido al promotor

    • TFIIIB se une al TFIIIC

    • TFIIIB dirige a la polimerasa al sitio correcto
      
      
      

    8. Métodos de localización de elementos reguladores de la transcripción

• Series de deleción de las regiones en posición 5’ al sitio de inicio de la transcripción

  • Utilización de un gen “chivato” (reporter)

  • Expresión del gen bajo el control de las secuencias que queremos estudiar

  • Construcción de mutantes con secuencias de control cada vez mas cortas

  • Evaluación de los niveles de expresión del gen “chivato”

  • Localización de las regiones importantes para el control del inicio de la transcripción

• Linker scanning mutations

  • Permite identificar las secuencias importantes dentro de un promotor

  • Concepto: Manteniendo el tamaño del promotor, vamos cambiando secuencias dentro de él sucesivamente.

  • Para medir los niveles de expresión también se utiliza un gen “chivato”