DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

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BIOLOGÍA MOLECULAR

Licenciatura en Quimica

Especialidad: Química Médica

 

Tema 8. Actividades básicas en biotecnología del DNA

 

1. Introducción

• Cómo se empezó a conocer la información contenida en el DNA
  

  • Clonado de fragmentos de DNA

  • Dos enzimas claves: Enzimas de restricción y DNA ligasas

  • Inclusión de los fragmentos de DNA en vectores
    

• La esencia de la tencnología del DNA es la preparación de un gran número de moléculas idénticas con las que trabajar

• Los vectores pueden portar segmentos de DNA “exógeno”

• Los vectores se replican un gran número de veces al introducirse en una célula “hospedadora” y con ellos el fragmento de DNA “exógeno”

• Dos tipos de vectores principales:
  

  • Plásmidos de Escherichia coli

  • Bacteriófago lambda
    
    

• Otros vectores son capaces de portar grandes fragmentos de DNA: BACs y YACs

• En la actualidad la PCR “Reacción en cadena de la polimerasa” permite obtener gran número de copias de un fragmento de DNA sin necesidad de clonarlo
  

  
  

   

• Concepto de plásmido:

  • Molécula de DNA circular de cadena doble que no forma parte de los cromosomas

  • Existen de forma natural en bacterias, levaduras y algunas celulas eucariotas superiores

  • Tamaño desde pocas Kb a de 100 kb

  • Se replican antes de cada división celular

  • Su existencia natural es debida a que aportan beneficios a la célula que los porta

• Uso de los plásmidos como vectores de clonaje

  • Tamaño reducido (aprox 3 Kb)

  • Elementos esenciales:

    • Origen de replicación

    • Gen de resistencia a antibiótico

    • Región donde insertar el DNA “exógeno”
      

• Introducción de los plásmidos en células.

  • Proceso conocido como transformación en bacterias y transfección en células eucariotas

  • Proceso basado en los experimentos de Avery, Mc Leod y McArty en 1944.

  • La entrada del DNA en la célula se ve facilitada por la presencia de cationes divalentes (Mg2+ ó Ca2+)

  • Frecuencia de entrada muy baja: 1/10.000

  • Habitualmente entra una única molécula

  • Selección de las células transformadas: resistencia a antibióticos.
    
    

• Son enzimas bacterianos

• Son endonucleasas: digieren la doble hélice en regiones internas, no en los extremos

• Reconocen secuencias de entre 4 y 8 nucleótidos (algunas poco frecuentes reconocen secuencias mayores) a las que se denomina sitios (dianas) de restricción.

• Las secuencias reconocidas son repeticiones invertidas

• Los cortes generados en una molécula son absolutamente reproducibles, generando lo que se conoce como fragmentos de restricción

• Tipos de extremos generados en los fragmentos:

  • Extremos cohesivos

  • Extremos romos
    

• ¿Porqué el calificativo de restricción?: Sistema natural de modificación / restricción

• Existen varios cientos de enzimas de restricción distintas caracterizadas.
  

  
  
  

• La DNA ligasa cataliza la formación de enlaces entre los extremos 3’ y 5’ de los fragmentos de DNA.

• La complementariedad de bases en los extremos cohesivos facilita la unión de los fragmentos:
  

  • Débil estabilización por puentes de hidrógeno entre los extremos de los fragmentos

  • Los fragmentos digeridos con el mismo enzima de restricción son ligados fácilmente
    
    

• Los extremos romos se ligan con menor eficiencia
  
  
  
  

6. Los sitios de policlonaje facilitan la inserción de los fragmentos de restricción en los vectores

7. Construcción de librerías.

• Concepto de librería:

  • Librería genómica (genoteca): colección de clones que contienen el genoma de un organismo completo

  • Librería de c-DNA: Colección de clones que contienen copias de los mRNAs expresados en una célula, tejido u organismo.

  • Librería genómica del genoma humano:

    • Tamaño del genoma humano: 3 x 109 pb

    • Son necesarios 150.000 clones de un tamaño medio de 20 Kb.
      

• Restricciónes del uso de los plásmidos en la construcción de librerías:

  • Sólo se pueden clonar pequeños fragmentos de DNA

  • La baja eficiencia de la transformación en E. coli limita el número de clones que se puede obtener

• Ventajas e inconvenientes del uso del bacteriófago lambda en la construcción de librerías

  • Pueden clonarse fragmentos mas grandes

  • La eficiencia de la transformación es mayor que en el caso de plásmidos

  • La manipulación es algo mas complicada que en el caso de plásmido
    
    
    
    

   

8. Uso del Bacteriófago lambda como vector de clonaje

• Estructura proteica:

  • Cabeza: contiene el DNA

  • Cola: permite la infección

• Dos ciclos de vida: lítico y lisogénico

  • Ciclo lisogénico: el DNA se integra en el genoma de la bacteria

  • Ciclo lítico: el DNA se replica e incorpora en nuevas cápsides proteicas y abandona la bacteria tras lisarla. (generación de >100 viriones por bacteria)

• Regiones imprescindibles en el genoma del fago

  • Genes de las proteínas de la cabeza

  • Genes de las proteínas de la cola

  • Genes de la función lítica

• Region no imprescindible para ciclo lítico:

  • zona central

  • puede ser reemplazada por otro fragmento de DNA de hasta 25 Kb

• Proceso de ensamblado in vivo de las partículas virales:

  • Ensamblaje independiente de las proteínas de la cabeza y de la cola

  • El genoma del fago l forma concatámeros al encadenarse unas moléculas con otras por los sitios COS

  • Las proteínas A y Nu promueven el rellenado de las cabezas con DNA flanqueado por sitios COS

  • No puede entrar ningún DNA que no presente sitios COS en sus extremos

  • Las colas se unen a las cabezas rellenas de DNA

• Ensamblado “in vitro” de las partículas virales

  • Preparación de las cabezas y colas: infección con un virus con la proteína A mutada

  • El DNA de los fagos recombinantes se adiciona a una mezcla de cabezas y colas vacías que contiene proteína A

• Eficiencia de clonaje:

  • 1.000.000.000 colonias/mg DNA

  • 1000 veces superior a la transformación con plásmidos

• Estrategia de construcción de una librería en el bacteriófago l
  
  
  
  
  

9. Identificación de los clones que contienen una secuencia determinada.

• Concepto de sonda marcada de DNA

• Proceso de desnaturalización y renaturalización del DNA:

  • Desnaturalización debida a cambios de temperatura o a pH>11

  • Las secuencias complementarias se separan

  • Sólo las secuencias complementarias reasocian

• Identificación de clones: la sonda se pega a secuencias complementarias en los clones

• Estrategia de detección:

  • Desnaturalización del DNA de los clones

  • Transferencia del DNA de los clones a un soporte sólido (membrana)

  • Unión irreversible del DNA a la membrana

  • Hibridación de la membrana con la sonda desnaturalizada

  • Localización de los clones que dan una señal positiva
    
    
    
    

10. Amplificación del DNA por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)